A könyvtár egy 1538 óta folyamatosan működő, évszázadokon át bölcseleti, teológiai és jogi fakultással is rendelkező főiskola szolgálatában formálódott. Színvonalas iskola soha nem működhetett könyvtár nélkül, így az intézmény minden bizonnyal egyidős a Református Kollégiummal.

A gyűjtemény csak a XX. században kapott egyházkerületi hatáskört, de a fenntartó város, - amelynek tanácsa egykor a " mi iskolánk" - nak nevezte a Kollégiumot 1561 óta működő nyomdájával mindvégig a tiszántúli régió természetes kulturális centruma volt. A középkori Debrecen könyvkultúrájának öröksége az 1564-es tűzvész alkalmával megsemmisült, a jelenlegi gyűjtemény így a reformáció évszázadából ered, és a reformáció művelődési programja értelmében fejlődött.

Az állomány gyarapításában diákok, professzorok, lelkészek, városi polgárok ajándékainak, hagyatékának mindvégig nagy szerepe volt. 1762-ig az ajándékozott könyvek száma meghaladta a vásároltakét. Az adományozó személy művelődéstörténeti jelentősége és a kollekció összetétele miatt külön említésre méltó Maróthi György (1715 - 1744) a Kollégium egyik legnagyobb tanáregyénisége, Bod Péter (1712-1797) nagyenyedi könyvtárnok-egyháztörténész, és Kármán András (?-1761 ) losonci rektor hagyatéka. Récsey János esperes (1754-1836) 864 műből álló könyvtára kortárs angol és francia egyházi szónoklatokban gazdag, Kazinczy Sámuel (1803-1855) 578, Cseh-Szombati József (1748-1815) 3736 kötetes orvosi szakkönyvtárat, Sárváry Pál professzor (1765-1846) 848 kötetes építészeti és természetrajzi, a Kollégium új épületét tervező Péchy Mihály ( 1755-1819) 807 kötetes építészeti szakkönyvtárat hagyott a Nagykönyvtárra. A magyarországi polgári magánkönyvtárak közül elsősorban bibliofil értékei révén emelkedik ki Kazzay Sámuel (1711-1797) debreceni gyógyszerész közel 2500 kötetes gyűjteménye, amely 36 régi magyar könyvével, kódexeivel, kéziratos térképeivel valóságos hidat teremtett a középkor öröksége, a reformáció és Debrecen puritán műveltsége között.

A Kollégium első korszakát Wittenberg, Melanchthon és Sturm pedagógiai hatása jellemzi. A könyvállomány már ekkor lehetővé tette a szabad művészetek, az ókori klasszikusok, a szent nyelvek, a filozófia és a teológia kor színvonalán történő oktatását. Már a legelső, 1706-ból fennmaradt könyvtári jegyzékben jeles alkotások képviselték az orvostudományt, jogtudományt, csillagászatot és botanikát is. Az intézményt a protestáns Európával kialakított kapcsolatai tették a nemzeti kultúra fontos műhelyévé. Professzorai - köztük a könyvtárért felelős "Bibliothecae Prefectusok"- csak többéves nyugat-európai peregrináció után állhattak katedrájukra. Történetileg az is formálta az iskolát, hogy Magyarországon a protestantizmus vált a katolikus Habsburg dinasztia elleni rendi-függetlenségi harcok ideológiai támaszává. A háborúkat lezáró békekötések első pontjai között mindig ott szerepelt a protestáns vallásszabadság biztosítása. A Rákóczi-szabadságharc idején 1705 és 1707 között több ízben is menekülni kényszerült a diákság, így a gyűjtemény jelentős károkat szenvedett. (A történelem későbbi viharai, köztük 1849 és 1944 hadi eseményei nem okoztak komoly pusztítást.) A XVII. században a reformátorok és ellenfeleik, angol és németalföldi puritán szerzők között Descartes, Cocceius, Keckermann és Erasmus művei jellemzik az állományt, majd a svájci és németalföldi ortodoxia, míg az 1730-as évektől feltűnnek az első francia grammatikák és wolffiánus szerzők.

A könyvtár 1744-ben érkezett történetének egyik legjelentősebb fordulatához: a Kollégium akkori felettes hatósága, a városi tanács, a professzori karból állíott igazgatót a Coetus könyvtára élére, melyet korábban diák tisztségviselők kezeltek. Bár a diákönkormányzat sorvadásával értékes hagyomány veszett el, a vásárlásokra alapozott tervszerű fejlesztésben, a szakszerű ügyvitelben nagy előrelépés történt. A gyűjtőkör - a temészettudományokat is magába foglaló filozófia oktatása érdekében - ekkortól válik szinte egyetemessé. Már az első igazgató - a Voltaire fordító, később szuperintendensnek választott Szilágyi Sámuel - festményekkel és raritásokkal ékesített barokk jellegű teremkönyvtárat hozott létre. Ez a fordulat sem változtatott azonban alapvetően a szerzeményezés célján és jellegén, a könyv továbbra is használati eszköznek, az oktatás és a felkészülés eszközének minősült. Bibliofil szempontok vagy az archiválás igénye sokáig nem kerülhettek előtérbe. A könyvtár nem elzárt főúri könyvmúzeum volt - nyitva állott a város könyvet használó rétegei előtt is.

A XVIII. század második fele a könyvgyűjtés aranykora volt Magyarországon. Ez az időszak megtízszerezte és tartalmilag is megújította a század elején még kb. 2000 példányból álló gyűjteményt, annak ellenére, hogy a cenzúra és a könyvrevízió megnehezítette a gyarapítást. A városi tanács 1759-es kötelespéldány rendelete következtében az Egyházkerületi Nagykönyvtár őrzi talán legteljesebben a református egyházhoz szorosan kapcsolódó debreceni nyomda termékeit. A könyvtárosok szakmai tájékozódását és a tervszerű fejlesztést segítették a külföldi könyvtári katalógusok: már az első könyvtárjegyzék tartalmazta például a lejdeni egyetemi könyvtárét. A hasonló művek számát tudatosan gyarapították, ráadásul a század végén egyetlen magángyűjteménnyel 66 nyomtatott katalógus és írói lexikon került az állományba. A könyvtár ezekben az években megszerezte a legfontosabb történeti és életműsorozatokat, a felvilágosodás nagyjainak olykor 70 kötetes Oeuvres Completes- eit, és annak ellenére, hogy a bekerült könyvek tematikájában a teológia ugyanúgy őrizte vezető helyét mint a nyelvek között a latin, Hatvani, Sinai és Budai igazgató professzorok jó érzékkel szerezték be Newton, Musschenbroek, Gassendi, Wolff, Leibniz, Linné, Thomas Hobbes, John Locke, Pascal, Raynal, Montesquieu, Woltaire, és Rousseau műveit.

Figyelemre méltó a folyóirat-gyűjtemény gazdagsága is. A kezdetektől a XVIII. század végéig hiánytalanul az állományba került például a három legrégibb és legrangosabb európai tudományos folyóirat: a Journal des Savants (Párizs, 1665- ) a Philosophical Transactions (London 1666- ) és az Acta Eruditorum Lipsiensium (Lipcse, 1682- ) számos francia, német, latin és angol nyelvű periodika, akadémiák és tudós társaságok sorozatai és bibliográfiák társaságában.

A XVIII. század második felében, főként Sinai Miklós professzor igazgatása alatt (1760-1790 között) gyakran adódott, hogy többet áldozhattak könyvbeszerzésre mint a Budára helyezett, alapítványokban dúskáló nagyszombati egyetem. A XIX. és XX. században azonban a gyűjtemény már nem állhatta a versenyt a nagy városi könyvtárakkal. Bár Péczely József (1789-1849) és Lugossy József (1812-1884) idején a könyvtár sajátos értékei továbbra is gyarapodtak - elsősorban a főiskolai tanszékek igényeit követve - a fejlesztést egészen a napjainkig bénították anyagi gondok. A Kollégium tanszékeiből a tanári kar zömének átvételével 1914-ben alapították meg a Debreceni Magyar Királyi Tudományegyetemet. Varga Zsigmond könyvtárigazgató 1913 és 1943 között főként a régi és ritka állomány hiányainak pótlásában jeleskedett, de a történetileg kialakult egyetemes gyűjtőkörnek a XX. században már csak válogatott irodalmát sikerült szerzeményezni, különös tekintettel a humán és társadalomtudományok, ezen belül a magyar nyelv és irodalomtudomány, a magyar és egyetemes történettudomány, a klasszika-filológia a magyar és egyetemes jogtudomány, a művészettörténet, a filozófia és lélektan, az orvostudomány, pedagógia a neveléstörténet, a földrajz, a művelődés- és tudománytörténet irodalmára, törekedve a régi állomány kutatásához szükséges kézikönyvtár kiépítésére. Az intézmény 1956-ban teológiai szakkönyvtári besorolást, 1983-ban tudományos könyvtári minősítést kapott.